Tamara Maldonado Romero
Yaiza Medina Chans
Raquel Moreno Gonzalez
Lidia Muñoz Bolaño
Ana Mª Sánchez Carvajal
Estas son las recetas que hemos buscado de germinación in vitro de polen.
Germinación
in vitro del polen de olivo.
Material
y métodos.
El polen se ha recogido y
se ha embolsado con bolsas de papel y se ha almacenado hasta su
utilización en tubos de ensayo a -20ºC. En la puesta a punto del
método se ha utilizado polen de ‘Picual’, un cultivar que
presenta buen cuajado en plantaciones monovarietales, y de ‘Leccino’
que ha destacado en algunos trabajos por su baja germinabilidad.
El medio de cultivo ha
estado constituido por una solución acuosa del 10% de sacarosa y
0´01% de BO3H3
preparada en el momento de la incubación. En todos los
casos las repeticiones de un mismo tratamiento han sido
representadas por tubos de ensayo tapados con algodón graso con
objetivo de evitar la contaminación y permitir la entrada de
oxigeno. La incubación se ha llevado a cabo en una estufa a 25ºC.
Las observaciones se han
realizado en tres gotas por tuno colocadas en un portaobjetos sin el
cubreobjetos. Previamente se ha agitado el tubo para homogenizar la
muestra. Se han contado de 100 a 200 granos de polen por gota,
tomando campos al azar y haciendo uso de contadores manuales. La
longitud del tubo polínico se ha medido en cinco tubos por gota. Se
han considerado germinados los granos cuyo diámetro era inferior a
la longitud del tubo polímico.
Los datos, previa
transformación angular de porcentajes, se han elaborado mediante
análisis de varianza y teste de Duncan.
Fuente:
Desarrollo
de un método eficiente para la germinación invitro de polen de
sorgo.
Introducción:
El
objetivo del presente trabajo fue formular un medio artificial y
determinar las condiciones óptimas para germinar el polen de sorgo
in vitro. Para ello se usó un arreglo factorial de concentraciones
de sacarosa, ácido bórico y nitrato de calcio; se evaluó el efecto
del pH, la humedad relativa, el estado físico del medio y la etapa
de desarrollo floral sobre la germinación. El medio óptimo se
conformó por 0.7 M de sacarosa, 3.81 mM de nitrato de calcio, 1.21
mM de ácido bórico y 1% de agar con pH 6. La mayor germinación se
obtuvo con polen colectado justo después de la antesis en una
humedad relativa superior a 70%. Los granos de polen sin germinar y
la humedad relativa se correlacionaron negativamente (-0.47,
/?X).01). Con las condiciones descritas en este trabajo se obtuvo
hasta un 51% de germinación in vitro del polen de 14 materiales de
sorgo. Estas evidencias sugieren que para incrementar la germinación
in vitro se requiere una formulación óptima del medio, controlar la
humedad relativa (superior a 70%) y seleccionar la etapa fenológica
más adecuada para la colecta del polen (justo después de la
antesis).
Formulación
de los medios de germinación
Para
identificar la formulación óptima del medio de germinación se
realizó una combinación factorial de sacarosa (0, 0.4, 0.7, 0.9,
1.1 M), ácido bórico (0, 1.62, 2.43, 3.23 mM) y nitrato de calcio
(0, 2.12, 3.0, 3.81 mM) en medio sólido. Con el objetivo de
optimizar la concentración de cada componente se realizó una
segunda combinación factorial con rangos más reducidos de sacarosa
(0.6, 0.7, 0.8, 0.9 M), ácido bórico (1.22, 1.62, 2.02, 2.43 mM) y
nitrato de calcio (2.81, 3.0, 3.5, 3.81 mM). Como testigo se usaron
los medios reportados por Lansac et al. (1994), y Tuinstra y Wedel
(2000) para polen de sorgo {Sorghum bicolor), y por Burke (2007) para
pasto Johnson (S. halepense). Las soluciones de sacarosa, ácido
bórico y nitrato de calcio se prepararon con agua destilada al doble
de su concentración, se esterilizaron por filtración con una
membrana de 0.45 μm, se les agregó un volumen de agar al 2%
esterilizado en autoclave y se vertieron en cajas de Petri de 60 x 15
mm. Sólo el medio de Lansac et al. (1994) se evaluó en forma
líquida.
Determinación
de la germinación in vitro del polen
Para
evaluar la formación del tubo polínico se suspendieron 20 mg de
polen en un mililitro de sacarosa al 30% y se sembró una alícuota
de 100 uL en cada uno de los medios. Las cajas se incubaron en
obscuridad durante 4 horas a 30 °C, y posteriormente se determinó
el porcentaje de granos germinados, granos rotos, y con tubos
polínicos mal estructurados (crecimiento no rectilíneo) entre 200
granos contados en un microscopio modelo BX61 (Olympus®) con luz
blanca a una magnificación de 20X. Las imágenes se analizaron con
el software Image-pro plus
V4.5.0.29
(Media Cybernetic Inc.). Los granos de polen se consideraron
germinados cuando la longitud del tubo polínico fue igual o mayor al
diámetro del grano.
Para
determinar el estado físico y pH óptimo del medio se comparó el
porcentaje de germinación del polen en el medio sólido optimizado
en este trabajo con su contraparte líquida a pH de 5, 6 y 7 ajustado
con ácido nítrico 0.1 N o hidróxido de sodio 0.1 N.
El
medio y las condiciones de germinación seleccionadas se usaron para
evaluar la germinación de 14 materiales de sorgo: A16, A20 A71, B9,
B22, B73, Fortuna, Perla, SBB25, Sureño, S23, VarB, 106B y 108B.
Fuente:
Estas son algunas de las plantas que hemos visto con una lupa binocular:
Estas son algunas de las muestras de polen que hemos visto a lo largo del trimestre con el microscopio:
